中山大学学巧自概科学巧文章缩号：13重组腺病毒载体的包装和表达周智，姚集鲁，卢建溪，炼文思，刘淑芳中山度科大学巧属弟互巧传染巧科实验《，广东广州引6泌巧要：为巧索巧体在星因巧中的应及巧表法目的抗巧的有巧性。用拓》出、执双切质巧脚usriptKS邸s，回收S巧因传段。运向化输入质粒pAVpL中相岛的巧切位点。巧过快速抽巧、巧鉴定巧结质检。蒋重巧粒与μJ17共转染293细胞进行包巧，巧单个空巧盛染24孔板中的2剪细巧，取上巧地《。4值*巧的里巧病巧扩大培养，巧化巧《定。井巧典PA3口、HePG2、VTO巧描，检巧HAg的表达。找取的泌个空巧染293细胞后。9个HBsA阳巧。扩大培养、辨化后说其巧度为9Kl伊pf知L，庙染PA3口、肤P2、Verol腊后72h，其上巧中HAgA值分别为也巧、0.供、0.化成功地构巧了表达HBHAg签因的直组巧我体，在巧3巧胞中进行了包装，巧在其它真巧细胞中巧到了表达。
关词：病巧性巧炎，型；谋病蒌体；04重组中田分类号：化12.36巧4文巧掠巧；基因治好已经开始用于遗传病、肿痛及病秦性疾病等的治疗试验，基因转巧方法是基因治疗的基础和关结。目前有物理化学法、病霉载体转移法。前者转效率低使巧受限，腺病毒载休作为基困治疗的运载系统具有宿主巧面广、巧殖滴度商、不整合、对止期细胞也能感染及相对安全等特点，近年来发展很快。本研究构建区1区缺失的重组喊病毒栽体，在巧3细胞中表达、包装，然后纯化病毒，并在口伯口、14沁2、￥细胞中表达，愚用于基因治疗实验，现将结果报道如下。
1材料和方法1.1.1巧权、巧袜和细化9091大小为8.8化，含5型戚病佩部分￡1区及包装信夸，巧卞育巧素耐药中山医科大学附属第王辟传染病科实验室保巧；98山5却1松瞄8，含册4亚型部分9说和3基因，受体茜加6钟加7含腺病希5型基因酵，并在61区巧人8胁4.3比重庆控科大学肝炎巧究巧惠巧，因其超过包装长度，在细化中不能包装成病巧粒。293细胞，为人胚肾细跑，用6征培养基培养；16沁2细胞：为人肝痛传代细胞系，巧DE培养基培养；Vero细胞非洲绿猴纳细胞，由中山匿料大学化生物巧研室巧元巧±巧。PA3口是Nffl/3巧TK细胞用逆转录病毒的包装信基金项目：巧26届中国巧十盾基金资助巧目[1陪9]17中山医科大学巧研岳动甚金资助项目收《日期：20004换巧：作者苗介；巧智19化，巧。控学巧±，巧师：研巧方巧：型肝炎基因治巧、塞菌免巧和治疗性玄巧苗的研巧，号和单纯疮疹病辜的1基因转化而来，中山医科大学附属第三院传染病科实验室保存。
1.1.2各种巧来源限制性内切酶公aHI、肪oRI、T4DNA连接酶购于Pega公司。
1.1.3试剂及其它琼脂糖，加拿大真达公司。快速质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒分别购于宝灵曼公司和助0RAD公司。Bato琼脂、EE及DE培养基GffiOLBRL公孔板、24孔板购于。8131公司。
1.2.1重组质粒的构建用疏HI、￡oRI从pBlusriptKS拙s质粒中切取S基因片段，插入载体pAVpL中相应的酶切位点，如图l.
1.2.2重组栽体与pJ17共转染空斑挑取鉴定用6孔板培养细胞，待细胞80~撕％融合时，按转染试剂盒说明书进行操作，于转染后4~5h，吸去细胞培养基，在细胞表面巧盖42~45==0.8的营养琼脂，待空斑出现后挑取空斑，感染24孔板中的巧3细胞，细胞完全出现病变后，取上清测选其4篼者扩大培养，扩增重组病抗0民1.2.3重组腺病毒栽体扩大培养、初步纯化及滴度测定90融合，吸去培养基，加入适当浓度的病毒脾箱中，每301轻摇混匀1次，共2打，然后加人含f =2牛血清的EE，每天观察细胞形态2次，待细胞完全出现病变变圆，尚未完全自瓶壁脱落，约4811，收集细胞悬液，1000r/in离屯、5in，细胞沉淀用P胎洗3次，收集细胞，冻存于70t.
抽吸打断细胞DNA，即得到初步纯化的重组腺病毒进步用sl超速离心。
l.2.4重组化病毒栽体在PA3l7、HePG2及Ven细胞中表达感染方法同上，于感染后24h、72h取上检测册sAg.
pAVpレHBs重组体的构建技术路线2.1重组蒌体的构建、鉴定如困2所示，重组体经公、及酶切后有2条带，大片段与空载体在同位置，而小片段与8基因在同泣置，载体约8.8化，目的基巧约9咕，说明蛋组体构连成功。
2.2重组载体的包装、空班挑起及巧度巧定巧迅载体与口共转染293细胞后3~41，空巧开始出现，第61巧明显。
随机挑取20个空琼巧染293细施盾，9个感染孔细胞上巧册从3阳巧，取邮846.4毋的21分黄0.45，0.的病被感染2期细胞进步扩大培养，纯化后3次测巧重姐病巧度为1.2xl08.8xl妒，7.9x 2.3亟组蒌体在巧核中表达亟姐病感染巧核细胞后不巧时间地sAg的表达如表l检测波长4讯l，uto￡f巧1巧52PAVp晒s巧进体的货巧鉴定1重组胜病毒栽体足判、比；02及口细化中的表达化巧0.巧0，拟0.说0为3次巧运巧甲巧值立型肝炎病巧感染启忌成为巧性，宜反复发作，病巧迁延，展终导致肝巧化、肝癌。
虽巧在抗巧赛治巧方面有巧，干犹索、糕酸巧似顿仅在治疗期间显巧定巧效，化停药盾反靴，：取巧待链长久的疗巧。核巧、反义核致化化巧留在体化细胞水平。尚难在临巧实巧，因化寻找更为有效的型肝炎防治方法遗得巧要。近年随分子生物学的飞速发巧，公塘肝炎擎因疫苗、孽因治巧的研究，给型肝炎巧治巧7?条新途径。膝掏毒戳体宿主化围广泛，巧旌巧，不摸合，对巧化期细亦化感染，并县忌于扩请和制备，近年来发展较快，已用于体外及化床试验，宋化明显奉作用43.亟组腺病毒载体构建巧2种方式，是巧舍的基因的胺病的段DNA与男段DNA体外直接连接，巧转陪巧3辄胞包装，巧缺点是腺病毒0化4巧大，约36比，操作困难。二是将含腺病霉部分0仇4及目的基因的质粒与含巧病毒0巧部分的质粒巧]7共巧染293细胞，两质粒通过在巧胞巧同源重组，得到重组病毒。此方法相巧衙单，但效率较低。本研巧构建表达HBsAg的亟组赃病毒载体，与pJ共转染2巧细胞后，得到T成巧包装，在其它巧核部胞中亦有效地表达了目的抗原，方进步用于基巧治疗实验，消鹞巧免耐受巧定了甚拙。
发现人类媒病149个血巧型，用辛构建基旧转移教悴的多为4化和4化型。
腺病毒基因件、及￡1起始区和右徊端。战之间都可1插入外源基匹构建重组体。51区载化容量稍大，在体内不能皮，但虽姐病赛产置较低，而且只能在293编跑中才能复制、扩巧；￡3区载体不巧响病薄《制，产量荀，巧口眼，但该类载体病窗基因册除少病毒基产物多，免巧原性强。本研究将外渡甚因插人￡1区，主巧从安全性方面考巧。
凹周智，张定凤。重组腺病毒载体研究现状[1].中华肝脏病杂志，1典8，61：
(完)
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